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转录组入门(2)：读文章拿到测序数据

本系列课程学习的文章是：AKAP95 regulates splicing through scaffolding RNAs and RNA processing factors. Nat Commun 2016 Nov 8;7:13347. PMID: 27824034 很容易在文章里面找到数据地址GSE81916 这样就可以下载sra文件

数据下载部分

第一步：在PubMeb上查找文献

第二步： 根据文献的method部分找到RNA-Seq是如何存放的

第三步： 在GEO上查找GSE81916 GEO站点： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/

找到了NCBI的SRA工具下载所需要的SRR编号。

GEO网址： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE81916 分为两个部分：

FTP网址ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP075/SRP075747 可以分为以下几个部分

  • 所有SRA数据的共同部分： ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant
  • reads表示存放reads数据，在FTP可以看到另一个选项是analysis，表示分析结果
  • ByStudy表示根据Study进行分类，其他还可以根据实验ByExp,根据Run,ByRun.
  • sra/SRP/SRP075/SRP075747: 后面部分都是为了便于检索。

第四步：通过循环，分别用prefetch下载数据

for i in `seq 48 62`;
do
    prefetch SRR35899${i}
done

知识点：如何用循环批量下载数据 注： 数据很大，需要下载很久，这段时间去看文章所用的分析方法。

文章所用方法：

内容主要在Bioinformatic analyses部分 比对：

  • 比对软件：TopHat (v2.0.13)
  • 参考基因组：human reference genome (GRCh37/hg19)
  • GTF文件： GTF version GRCh37.70
  • 只保留MQ >30的map结果
  • Picard-tools (v1.126)： 计算平均插入大小(mean insert sizes)和标准差

read count: 软件：HTSeq v0.6.0

差异表达分析： DESeq (v3.0)

差异外显子使用分析： DEXSeq (v3.1)

GO富集分析：DAVID (http://david.ncifcrf.gov/).

实验设计： 样本9-15为mRNA-Seq测序结果，用于分析人类293个细胞（9-11）和小鼠ES细胞（12-15）d的AKAP95敲出影响。

文章到底用RNA-Seq做了那些事情

为了评估AKAP95对AS的全局影响，他们删除了人类293 cell和小鼠ES细胞，通过RNA-Seq和DEXseq 分析找到细胞mRNA的不同外显子使用。由于DEXseq考虑到了生物学变异，因此对假阳性（False discovery)有可信的控制。在 293 cell 和 ES cell中，AKAPP95 KD都导致更多地外显子使用减少，意味着APAP95通过促进外显子融合调节全局地可变剪切（AS). 他们用PCR-based assay验证了结果。

文章用了火山图展示被影响地外显子，用饼图可视化多少个外显子被下调了。Fold change is the ratio of the normalized exon level in AKAP95 KD over that in control cells.

为了证明外显子使用(exon usage)降低不是因为基因表达量降低导致的技术偏差，作者从三个角度进行论证

  1. 工具角度，DEXseq根据基因的总外显子信号水平标准化每个外显子信号
  2. 数据分析，AKAP95 KD的细胞中那些外显子使用被影响的大部分基因，表达量没有降低，所以和表达量无关，还用图证明。Fold change is the ratio of the normalized exon level in AKAP95 KD over that in control cells.

3. PCR数据证实 4. 小鼠的也是如此

确定可变外显子使用是AKAP95的直接影响， 他们比较了AKAP95物理靶点（基于AKAP95 RIP-Seq)和功能位点（基于mRNA-Seq)。 那些AKAP95结合到内含子的基因和外显子使用显著性变化（AKAP95 KD）的基因显著性重叠。 逻辑就是： 如果A和B有关，那么有A就有B， 没有A就没有B，且这种关系不是偶然的。

确定AKAP95靶点参与的生物学通路，他们用了基因本体论（GO)分析了AKAP95的功能位点和物理位点。结果揭示那些AKAP95 KD 的293细胞中那些差异外显子使用的基因，显著性的富集在chromatin/transcription regulators and RNA processing factors。那些RIP-Seq找到基因也是如此。

综上， AKAP95可能通过直接和间接调节染色质，转录和RNA加工调节全局基因表达。